mRNA藥物是通過將編碼抗原蛋白的mRNA接種到人體，利用人體細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)進(jìn)行表達(dá)合成抗原蛋白，通過抗原蛋白誘導(dǎo)和激活機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。由于其具有較低的感染和突變風(fēng)險，能夠同時誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，免疫效能好，研發(fā)和生產(chǎn)周期短，容易實現(xiàn)量產(chǎn)等特點，目前被廣泛用于傳染性疾病、腫瘤及罕見病藥物的研發(fā)。
mRNA藥物在研發(fā)過程中，其穩(wěn)定性和藥物遞送是需要面臨的主要挑戰(zhàn)。裸露的mRNA很容易受到體內(nèi)RNA切割酶的攻擊，mRNA也需要被高效地遞送至細(xì)胞內(nèi)從而進(jìn)行翻譯，發(fā)揮功能。因此，mRNA藥物的關(guān)鍵技術(shù)為RNA的修飾與遞送。
mRNA藥物前期的研發(fā)工作主要集中在修飾 mRNA 的結(jié)構(gòu)元件上，特別是5’帽區(qū)，5’UTR 和 3’UTR，編碼區(qū)和Poly A 尾，修飾此類結(jié)構(gòu)能有效改善 mRNA 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和翻譯效率。除此之外，對mRNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征分析，也是保證 mRNA 安全性和有效性的關(guān)鍵。
01 加帽率及Poly A 尾檢測
在mRNA的結(jié)構(gòu)表征上，丹納赫生命科學(xué)擁有使用SCIEX高分辨質(zhì)譜及毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測的方案。由于mRNA全長較長、分子量較大，所以在進(jìn)行加帽率及Poly A 尾檢測時，需要通過酶切的方式獲得5’端的加帽短鏈及3’端的Poly A尾短鏈，然后分別進(jìn)行毛細(xì)管電泳及質(zhì)譜的檢測。
PA 800 Plus毛細(xì)管電泳制藥分析系統(tǒng)可以分離獲得加帽和不加帽樣本的分離峰，目前經(jīng)過優(yōu)化，基本可以得到達(dá)基線分離，從而可以獲得準(zhǔn)確的加帽定量檢測結(jié)果。對于100nt以內(nèi)的單鏈核酸，PA 800 Plus可以分辨相差1nt的產(chǎn)物，從而對Poly A 尾進(jìn)行檢測。
采用SCIEX的高分辨質(zhì)譜ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)進(jìn)行檢測，根據(jù)精確分子量，不但能檢測加帽和不加帽的樣品，還能區(qū)分不同的Cap種類。同時質(zhì)譜還能進(jìn)行Poly A的長度分布表征及相對定量。由于核酸表征分析需要加入離子對試劑，這對質(zhì)譜的抗污染能力提出了很高的要求。
02mRNA純度及完整性分析
mRNA在制備、加工、配方和長期儲存過程中可能會發(fā)生降解，因此通過對mRNA的純度及完整性分析，對于產(chǎn)品質(zhì)量保證和優(yōu)化制造工藝至關(guān)重要。使用PA 800 Plus匹配LIF檢測器可有效的依據(jù)mRNA片段大小來進(jìn)行高分辨率的分離和高靈敏度的檢測，該方法適用的mRNA范圍較廣，可進(jìn)行0.2 kb-10.0 kb范圍內(nèi)的分析。
合適的mRNA遞送載體可實現(xiàn)對mRNA的高效包載，并在體內(nèi)實現(xiàn)良好的表達(dá)效果�；谥惢蝾愔衔锏妮d體是目前mRNA疫苗最常用的非病毒類載體。各種合成的和天然衍生的脂質(zhì)已經(jīng)被用來形成脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒（LNP），兩者都被報道可以有效地遞送基于mRNA的疫苗。
無論是脂質(zhì)體或是脂質(zhì)納米顆粒包裹mRNA后的顆粒大小、粒徑分布等都是影響遞送效率的最主要的參數(shù)，丹納赫生命科學(xué)擁有對載藥脂質(zhì)體進(jìn)行不同維度檢測的方案。
03載藥顆粒形態(tài)學(xué)觀察
采用冷凍透射電鏡進(jìn)行載藥脂質(zhì)體的檢測可以直觀地觀察脂質(zhì)體的分布形態(tài)、顆粒大小和顆粒完整度，并且冷凍處理載藥脂質(zhì)體是在生理狀態(tài)下對載藥脂質(zhì)體進(jìn)行冷凍保存，不會對脂質(zhì)體造成破壞，所獲得的結(jié)果更加真實、清晰、準(zhǔn)確。徠卡顯微系統(tǒng)擁有全套的冷凍制樣設(shè)備，包括對電鏡載網(wǎng)的噴鍍連續(xù)碳膜和輝光放電處理的EM ACE600，以及能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品安全冷凍的投入冷凍儀EM GP2，可以便捷地完成高質(zhì)量的載藥脂質(zhì)體的冷凍前處理。
04載藥脂質(zhì)體包封率檢測
另外，還可以采用分析型超速離心機對載藥脂質(zhì)體的顆粒大小分布進(jìn)行檢測，并計算游離與膠囊化藥物的比例，為脂質(zhì)體或是脂質(zhì)納米顆粒與mRNA藥物的混合比例提供指導(dǎo)。采用分析型超速離心機進(jìn)行載藥脂質(zhì)體檢測的優(yōu)點是：使載藥脂質(zhì)體保持天然狀態(tài)，沒有破壞性，并且檢測完后可回收。
05載藥脂質(zhì)體粒度分布檢測
粒度分布是指在一定的粒徑檢測范圍內(nèi)，對脂質(zhì)體顆粒的大小進(jìn)行分析，得到粒徑分布圖和相應(yīng)的粒徑分析結(jié)果（包括中位粒徑D50，平均粒徑Mean Diameter），以此控制生產(chǎn)的脂質(zhì)體顆粒大小，以及用于生產(chǎn)質(zhì)控，保證批次間的一致性。因為粒度分布可影響納米載體體內(nèi)分布從而影響被動靶向，所以是檢測載藥脂質(zhì)體的重要指標(biāo)。貝克曼庫爾特的LS 13320 XR 激光粒度分析儀采用先進(jìn)的偏振光強度差散射（PIDS）技術(shù)與激光衍射相結(jié)合，可對納米級別的載藥脂質(zhì)體粒度分布進(jìn)行精確檢測。
06細(xì)胞外囊泡的檢測
體液中的細(xì)胞外囊泡（EV）是由多種細(xì)胞分泌的攜帶有核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)的一種納米囊泡，在體內(nèi)可發(fā)揮細(xì)胞通訊和物質(zhì)傳遞的作用。因其具有良好的生物相容性、高生物滲透性和低免疫原性、低毒性等優(yōu)點，被越來越多地用于mRNA藥物的遞送系統(tǒng)的研究。
流式細(xì)胞儀可以對EVs和其他生物顆粒（包括病毒和細(xì)菌）進(jìn)行定量和多參數(shù)表征。但實際上，最靈敏的傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀已被認(rèn)為無法檢測到直徑小于300納米的EVs。由于微泡大小的范圍實際上延伸至150 nm，而外泌體的直徑在30–150 nm之間，因此這導(dǎo)致了一個共同的認(rèn)知，即流式細(xì)胞儀只能檢測到EVs的冰山一角。
貝克曼庫爾特的CytoFLEX系列流式細(xì)胞儀是一種基于半導(dǎo)體集成電路化的流式細(xì)胞儀，將硅雪崩光電二極管（APD）與波分復(fù)用（WDM）結(jié)合，優(yōu)化的流通池設(shè)計和二極管激光器配對使信號強度遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀，而噪聲遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀。另外，CytoFLEX上的紫色SSC（VSSC，405 nm）充分提高了小顆粒檢測的靈敏度。
