島津成像質(zhì)譜顯微鏡應(yīng)用專題黃皮代謝物研究
黃皮不同部位中代謝物分子空間分布的質(zhì)譜成像分析
黃皮（Cluasena lansium（Lour.）Skeels）屬于蕓香科(Rutaceae)黃皮屬(Clausena)中的一種特殊果樹，分布在中國南方地區(qū)。黃皮以其果實聞名于世，是非常受歡迎的熱帶保健水果，其根、莖、葉和種子也被廣泛應(yīng)用于民間醫(yī)藥或中藥中。
以往對該植物的化學(xué)研究主要集中在尋找具有藥用價值的生物活性成分，到目前為止，已經(jīng)分離和鑒定一系列天然產(chǎn)物，這些物質(zhì)具有明顯的抗腫瘤、抗炎、抗氧化及降血糖等作用，主要包括咔唑類生物喊、香豆素類化合物、酰胺類生物堿、萜類和黃酮等。其中咔唑類生物堿和單萜基香豆素為其特征性成分。有關(guān)黃皮中活性成分的分離和測定方法已得到廣泛報道，然而，人們對黃皮特征代謝物在組織內(nèi)的分布卻知之甚少。對黃皮果中的化學(xué)成分進(jìn)行研究，探究其中具有藥用價值的生物活性成分空間分布信息，有助于理解植物代謝物合成的調(diào)控機(jī)制和功能基礎(chǔ)，對黃皮保健食品的開發(fā)具有重要意義。
質(zhì)譜成像技術(shù)是近年來受到關(guān)注的一種新型的分子成像技術(shù)�；诟哽`敏、高分辨、高通量特性的質(zhì)譜結(jié)合先進(jìn)的顯微成像技術(shù)，樣品制備過程不需要組織粉碎，無需標(biāo)記即可實現(xiàn)多種物質(zhì)在組織中的原位分布，為多種代謝物的研究提供了更多的信息維度。
本研究通過優(yōu)化樣品前處理方法，采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像技術(shù)(MALDI-MSI)對黃皮(Clausena lansium, Lour)的組織分布特征進(jìn)行研究，為更好地開發(fā)、利用黃皮這一藥食兩用的水果資源提供理論基礎(chǔ)。本研究是首次利用質(zhì)譜成像技術(shù)實現(xiàn)對黃皮小分子代謝物的系統(tǒng)研究（見圖1）。
1. iMScope TRIO 成像質(zhì)譜顯微鏡測試條件
將不同部位的組織塊包埋在2%羧甲基纖維素（CMC）中進(jìn)行冷凍切片，切片厚度為 25μm，將所得組織切片放置在 ITO 導(dǎo)電載玻片上（100 Ω/m2，日本大阪松浪玻璃），將載玻片在真空干燥箱中干燥20分鐘。使用帶有0.22 mm噴嘴的噴槍（PS-270，GSI Creos，日本東京）和基質(zhì)升華設(shè)備iMLayer（Shimadzu，Kyoto，日本）進(jìn)行基質(zhì)涂敷。在噴槍法中，使用1mL 40mg/mL DHB溶液（0.1%TFA，70%甲醇水配置）作為基質(zhì)，噴槍與載玻片保持10cm的距離， 每噴霧10s后干燥5s，循環(huán)噴霧-干燥過程，直到將1 mL DHB溶液噴涂于切片并干燥完全。對于升華法，使用iMLayer設(shè)備將基質(zhì)升華于組織切片表面，厚度為0.7μm DHB。所有數(shù)據(jù)都是在裝有MALDI離子源的iMScope TRIO（Shimadzu，Kyoto，日本）上采集，質(zhì)譜條件如下：正離子模式采集, 采集質(zhì)量范圍 m/z 100-1000, 激光強(qiáng)度50。
2. 基于 iMScope TRIO 成像質(zhì)譜顯微鏡的組織成像研究
采集黃皮植物不同部位作為研究樣品，分別對應(yīng)果實、小莖、葉片。采用iMScope TRIO 成像質(zhì)譜顯微鏡對三個不同部位的橫切面進(jìn)行了生物堿、香豆素、糖及小分子酸等內(nèi)源性分子的空間分布分析。
如圖2所示，3-甲基咔唑和Murrastinin在果實全果均有分布，尤其在果核含量特別豐富。在黃皮小莖中，這兩個物質(zhì)主要存在于木質(zhì)部和髓質(zhì)部，表皮含量較低。此外，在葉片的上下表皮含量豐富。Murrayanine和heptaphylline這兩種咔唑堿僅分布于果肉組織中，莖中含有少量，果皮、果核和葉片中幾乎不存在。而Girinimbine只存在于黃皮果核外皮以及莖的外表皮。黃皮屬植物咔唑類化合物通過直接細(xì)胞毒性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和/或免疫增強(qiáng)作用抑制腫瘤生長，他們的抗癌潛力引起了越來越多研究的興趣。通過定位該類物質(zhì)的組織分布，可以有效提高活性成分的提取效率。
此外，如圖3所示，香豆素類化合物在黃皮中的分布是相似的，主要存在于果皮中。有報道稱，香豆素類化合物的抗氧化、抗癌及抗炎癥方面發(fā)揮重要作用。糖類廣泛存在于植物中，是植物快速儲能物質(zhì)。
如圖4所示，己糖（葡萄糖和果糖）主要分布在黃皮果實的果肉當(dāng)中，蔗糖分布在果皮、果肉以及果肉中纖維上。水果中產(chǎn)生的蔗糖由蔗糖轉(zhuǎn)化酶水解成葡萄糖和果糖，黃皮切片中蔗糖的檢測強(qiáng)度約為己糖的4.7±1.4倍，說明黃皮中糖類主要以蔗糖的形式存在。據(jù)文獻(xiàn)報道，葡萄糖和果糖的甜度分別是蔗糖的0.75倍和1.7倍。因此，這很好地解釋為什么黃皮果品嘗比其他水果酸。
本研究結(jié)果有助于更好的了解黃皮內(nèi)源性生物活性物質(zhì)在不同組織部位的分布，為黃皮成分識別、質(zhì)量評價、高值化利用等提供參考。
本文相關(guān)內(nèi)容由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測技術(shù)研究所唐雪妹博士提供，詳細(xì)研究內(nèi)容已正式發(fā)表于Phytochemistry, 2021, 192:112930.
