黃曲霉毒素（Aflatoxins, AF）是一類由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具有誘發(fā)人體致畸、致癌、致突變的作用，主要的污染物有黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2。中藥材大多以天然植物為基源，在儲(chǔ)存不當(dāng)或因其他外界條件影響時(shí)，易受霉菌污染產(chǎn)生黃曲霉毒素。因此對(duì)中藥材進(jìn)行黃曲霉毒素的高效便捷檢測(cè)是十分有必要的。

 

       2.儀器、試劑及耗材

       儀器

       Raykol Fotector Plus 高通量全自動(dòng)固相萃取儀

       Raykol Auto EVA-60 全自動(dòng)平行濃縮儀

       Raykol AH-30 全自動(dòng)均質(zhì)器

       Raykol Auto Prep 200 全自動(dòng)液體樣品處理工作站

       高效液相色譜（HPLC）：Agilent 1200

       質(zhì)譜檢測(cè)器 (MS)：Agilent 6430

       耗材

       黃曲霉毒素免疫親和柱

       試劑

       緩沖液：稱取25 g氯化鈉、5 g碳酸氫鈉溶于水中，加入0.1 mL吐溫-20，用水稀釋至1000 mL即得淋洗緩沖液。

       使用Auto Prep 200全自動(dòng)液體樣品處理工作站配制黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

 

       3.樣品提取與前處理

       陳皮、人參、當(dāng)歸試樣前處理

       準(zhǔn)確稱取15 g試樣于120 mL離心管中，加入3 g氯化鈉及75 mL甲醇-水溶液（7:3，V/V），12000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌速度下均質(zhì)2 min，離心5 min（轉(zhuǎn)速4000 r/min）。準(zhǔn)確量取15 mL上層提取液于50 mL容量瓶中，用水定容、取30 mL至50 mL離心管中, 離心10 min（轉(zhuǎn)速4000 r/min），最后準(zhǔn)確移取20 mL上清液至80 mL玻璃上樣管，待凈化用。

       凈化方法

      凈化過(guò)程采用黃曲霉毒素免疫親和柱進(jìn)行富集凈化，具體方法如下：

       清洗樣品通道：用甲醇清洗；

       上樣：采用2 mL/min的流速進(jìn)行精確上樣20 mL；

       淋洗：采用緩沖液和純水進(jìn)行淋洗小柱；

       氣推：用60 mL空氣將水?dāng)D出免疫親和柱；

       洗脫：以0.5 mL/min的速度用甲醇進(jìn)行洗脫，開(kāi)始收集溶液；

       氣推：將柱子里溶液用空氣推出，收集溶液。

       將收集液用甲醇定容至2 mL，混勻后過(guò)0.22 µm濾膜用液質(zhì)檢測(cè)。

 

       4.液質(zhì)聯(lián)用色譜圖

 

       5.樣品測(cè)試

       基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

       選擇定量離子的峰面積作為縱坐標(biāo)，濃度作為橫坐標(biāo)，做相關(guān)曲線，曲線為線性回歸，各點(diǎn)權(quán)重相等，擬合出工作曲線，要求R2>0.99。

       基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

       在陳皮、人參、當(dāng)歸3種常見(jiàn)樣品基質(zhì)中添加水平為1.8 μg/kg的黃曲霉毒素G2、B2和6.0 μg/kg的黃曲霉毒素G1、B1進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證。

 

       6.總結(jié)

       A.提取液需加入水進(jìn)行稀釋、定容至50 mL后才可進(jìn)行凈化，以防止過(guò)多的有機(jī)溶劑使免疫親和柱失活。

       B.在人參和當(dāng)歸的凈化過(guò)程中，如采用20 mL水作為淋洗液，其加標(biāo)回收率為70~80%；而將10 mL的緩沖液和10 mL的純水作為淋洗液時(shí)，可除去免疫親和柱上殘留的色素和基質(zhì)，從而提高回收率。

       C.進(jìn)行洗脫時(shí)甲醇的過(guò)柱流速控制在1滴/s為宜。洗脫效果不佳時(shí)，可采取讓甲醇浸泡免疫親和柱后再加以洗脫。

       D.由于黃曲霉毒素在紫外光照射下不穩(wěn)定，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免紫外光和太陽(yáng)光的照射。

 

       7.解決方案優(yōu)勢(shì)

       通過(guò)高通量全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行凈化和富集，能自動(dòng)化進(jìn)行免疫親和柱自動(dòng)脫帽和樣品上樣、淋洗和洗脫等過(guò)程，8種溶劑可選，6個(gè)樣品通道同時(shí)運(yùn)行，能連續(xù)、批量處理多樣品，實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化固相萃取過(guò)程。

       整體解決方案可實(shí)現(xiàn)樣品快速高效處理，提高工作效率。同時(shí)自動(dòng)化前處理解決方案可解放實(shí)驗(yàn)人員雙手，也避免有機(jī)溶劑的毒害。